La biopsia consiste nel prelievo di liquido o di tessuto per stabilire con certezza la presenza o meno di carcinoma. In genere, per la biopsia la paziente viene indirizzata al chirurgo.
 
Talvolta, la mammografia evidenzia un'area sospetta che non era stata individuata tramite la palpazione clinica. In questo caso, è possibile utilizzare tecniche diagnostiche di imaging per visualizzare l'area interessata e prelevare un campione di tessuto, come la biopsia ecoguidata con ago sottile o stereotassica.
 
Il tessuto può essere prelevato dal seno con diversi sistemi:

• Aspirazione con: un campione di liquido e/o cellule viene prelevato da un nodulo ago sottile del seno per mezzo di un ago sottile. Se si sospetta che il liquido contenga cellule degenerate, il campione viene inviato in laboratorio dove sarà analizzato al microscopio da un patologo per verificare l'eventuale presenza di cellule tumorali. Se il liquido è chiaro, l'analisi in laboratorio non è necessaria.
• Biopsia incisionale: il prelievo di tessuto mammario viene eseguito con un ago di grosso calibro (punch); un patologo esamina il campione di tessuto alla ricerca di cellule tumorali. Questo procedimento, definito anche agobiopsia, non provoca la diffusione di cellule tumorali nel corpo.
• Biopsia chirurgica: nella biopsia incisionale, il campione viene prelevato chirurgicamente da un nodulo o da un settore anomalo. Nella biopsia escissionale vengono asportati l'intero nodulo o l'intero settore sospetto. Successivamente, un patologo esamina il tessuto per individuare eventuali cellule tumorali.

Se la presenza di cellule tumorali viene confermata, il patologo è in grado di stabilire di quale tipo di cancro si tratta: il cancro al seno più frequente è il carcinoma duttale che si sviluppa nelle pareti interne dei dotti galattofori. Un altro tipo di cancro, il carcinoma lobulare, si forma nei lobuli ghiandolari.